3D打印磷酸钙陶瓷孔隙架构与骨诱导性的关联及优化策略

zhiyongz 10分钟前阅读数 #技术

在骨修复领域，理想的骨替代物应具备个性化外形与可调节内部多孔结构，以满足精准医疗需求。3D打印技术的发展为制备复杂结构的骨替代物带来可能，其中数字光处理（DLP）打印技术具有成型效率高、精度高和表面质量好等优势，适用于制备多孔磷酸钙（CaP）陶瓷。CaP生物陶瓷因良好的生物相容性和生物活性，在骨科领域应用广泛。然而，目前3D打印CaP陶瓷的骨诱导性与传统发泡法制备的陶瓷相比存在较大差距，这限制了其在骨再生中的应用。尽管已有多种增强3D打印CaP生物陶瓷成骨能力的尝试，如掺杂、加载药物和添加生长因子等，但这些方法存在改变底物成分、潜在危害健康和成本高昂等问题。
四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心张兴栋院士、朱向东研究员、李向锋副研究员团队，通过优化孔隙架构来提升3D打印CaP陶瓷的骨诱导性。团队制备了具有六方密堆积（HCP）球形孔结构的CaP陶瓷，并构建了八面体、菱形和螺旋形结构作为对照。研究系统地探究了不同孔隙架构对陶瓷的结构、力学性能、渗透性以及细胞行为和体内骨诱导性的影响。相关工作以“3D printing calcium phosphate ceramics with high osteoinductivity through pore architecture optimization”为题发表在《Acta Biomaterialia》上。

不同孔隙结构的双相磷酸钙（BCP）陶瓷成骨活性示意图。

研究内容
1. 通过设计八面体、菱形、螺旋形和六方密堆积（HCP）四种孔隙结构的模型，使用DLP打印技术制备磷酸钙（CaP）陶瓷，利用立体显微镜、扫描电镜、X射线衍射仪和压汞仪等进行表征分析，研究了不同孔隙结构CaP陶瓷的微观和宏观结构、相组成、孔隙特征。结果表明，成功制备出具有特定孔隙结构的CaP陶瓷，其相组成包含HA和β -TCP ，不同结构的陶瓷在孔隙率、孔径等方面存在差异，且均有丰富微孔，晶粒尺寸相似。

图1. 具有八面体、菱形、螺旋形和六方密堆积结构的BCP生物陶瓷的顶部和侧面3D视图、光学照片、SEM图像、XRD图谱、孔径分布和孔数量分布。

2. 运用有限元分析和数值流体流动分析方法，结合万能材料试验机测试，研究不同孔隙结构CaP陶瓷的力学性能和渗透率。结果显示，HCP结构的CaP陶瓷压缩强度和弹性模量最高，应力分布更均匀；其流体流速和渗透率在四种结构中最低，螺旋形结构的渗透率最高。同时，孔隙几何结构对陶瓷烧结收缩率影响较小，八面体、螺旋形和HCP结构的比表面积无显著差异，菱形结构比表面积较低。

图2. BCP生物陶瓷的压缩强度测试观察、压缩载荷下孔隙单元的应力分布、模型内模拟流线、模型横截面的速度分布、压缩强度、弹性模量和实际渗透率分析。

3. 采用体外细胞培养实验，借助共聚焦激光扫描显微镜观察细胞生长和增殖，进行CCK-8实验检测细胞增殖，计算细胞层平均厚度，研究不同孔隙结构对MC3T3-E1细胞行为的影响。结果表明，细胞在各样本孔壁均能黏附和铺展，HCP结构组细胞生长均匀并形成圆环，虽然四组细胞增殖无显著差异，但HCP组细胞层平均厚度最大。

图3. MC3T3-E1细胞的死活染色和F-肌动蛋白的CLSM观察、高斯曲率、细胞生长轮廓、CCK-8结果以及细胞层平均厚度。

4. 对在不同孔隙结构CaP陶瓷上培养7天的MC3T3-E1细胞进行ALP染色，对培养14天的细胞进行OCN和BMP-2免疫荧光染色，采用实时定量逆转录PCR分析细胞培养7天和14天时相关成骨基因的表达，研究不同孔隙结构CaP陶瓷对细胞骨向分化的影响。结果显示，HCP组的ALP活性相对较高，能显著促进BMP-2和OCN的高水平表达，且在成骨基因（Col-I、Runx-2、Osx、Ocn和Alp）表达上表现更优。

图4. MC3T3-E1细胞在不同孔隙结构CaP陶瓷上培养的ALP染色、OCN和BMP-2免疫荧光染色、成骨基因表达以及OCN和BMP-2的平均光密度（MOD）值。

5. 将不同孔隙结构的CaP陶瓷植入犬肌肉内，在6周和10周后取材进行H&E染色、μ -CT扫描重建，研究不同孔隙结构CaP陶瓷的体内骨诱导性。结果表明，HCP结构组新骨形成最多，植入10周后新骨面积占比最高，骨体积分数（BV/TV）变化百分比最大，其骨诱导性在四组中最强。

图5. 犬肌肉内植入6周和10周后多孔BCP陶瓷的H&E染色、μ -CT重建3D可视化、骨发生率、新骨面积和BV/TV百分比变化。

6. 在犬肌肉内植入实验中，对植入6周和10周后的不同孔隙结构CaP陶瓷进行免疫荧光染色（CD31、α -SMA）和免疫组化染色（OCN），并分析相关蛋白表达的平均光密度（MOD）值，研究其体内血管生成和骨诱导相关蛋白的表达情况。结果表明，所有组的CaP陶瓷都能促进CD31和α -SMA的表达，HCP组在术后6周时CD31表达最高，10周时α -SMA表达显著高于部分组；同时，HCP组的OCN阳性表达明显更高。

图6. 犬肌肉内植入6周和10周后，八面体、菱形、螺旋形和HCP结构的CD31和α -SMA免疫荧光染色、OCN免疫组化染色以及CD31、α -SMA和OCN的MOD值。

7. 建立兔股骨髁临界尺寸缺损模型，植入不同孔隙结构的CaP陶瓷，8周后利用μ -CT重建和组织学染色，研究不同孔隙结构CaP陶瓷的体内骨再生能力。结果表明，HCP结构组与宿主骨整合良好，新骨形成量显著高于其他组，骨体积分数（BV/TV）、小梁数量（Tb.N）和小梁厚度（Tb.Th）等指标表现更优。

图7. 植入兔股骨缺损8周后，八面体、菱形、螺旋形和HCP结构的材料与新骨整合的3D重建μ -CT图像、亚甲基蓝和碱性品红染色、新骨体积与总缺损体积的定量分析、新骨面积、残余体积与总缺损体积、小梁数量和小梁厚度。

研究结论
本研究系统评估了不同孔隙结构对双相磷酸钙（BCP）陶瓷理化和生物学性能的影响。结果显示，在四种研究结构中，HCP组的抗压强度最高，渗透率最低。具有球形凹孔结构的HCP组，能够促进MC3T3-E1细胞的黏附、增殖和骨向分化。与八面体、菱形和螺旋形结构组相比，HCP组在体内表现出更优异的血管生成能力和骨诱导性。通过兔股骨髁缺损修复实验进一步证实，HCP组具有令人满意的骨修复能力。这些结果表明，构建具有六方密堆积结构、球形凹面的孔隙结构，是增强3D打印BCP陶瓷力学性能、骨诱导性和骨再生能力的有效途径。

文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2024.07.008