植物细胞3D打印优化：兼顾分辨率与细胞活性的策略探索

      细胞打印技术为植物组织工程的发展提供了技术支撑，在植物细胞微环境研究、高价值代谢产物生产、植物基食品制造以及定制化木材合成等领域展现出巨大潜力。然而，与已经相对成熟的哺乳动物细胞打印相比，植物细胞打印尚处于起步阶段，仍面临如细胞尺寸不均和剪切力敏感等挑战，难以同时实现高打印分辨率与高细胞活性。

       近期，清华大学机械系欧阳礼亮团队以胡萝卜细胞为研究对象，系统探讨了植物细胞团形态对生物墨水性能的影响，并提出“植物细胞团尺寸与针头内径匹配”的策略，旨在为植物细胞的工程化应用提供参数优化方案（图1）。

工作亮点

• 首次建立适用于挤出打印的植物细胞团-针头尺寸匹配准则

• 厘米级大尺寸载植物细胞结构的打印与稳定培养

• 挤出式打印对植物细胞功能影响的初步解析
  

研究内容
      基于悬浮培养获得的细胞团（S-Cell）的墨水活性与均匀性更好。本研究首先从胡萝卜外植体培养获得常规愈伤组织（R-Callus），随后通过物理破碎获得离散化愈伤组织（F-Callus），并采用悬浮培养获得细胞团（S-Cell）。其中S-Cell的尺寸最小（174±79 μm），活死染色结果表明，三种细胞形态的初始存活率均较高（R-Callus ~93%，F-Callus ~85%，S-Cell ~97%），因在制备过程中受机械剪切作用，F-Callus的存活率相对较低（图2）。

将三种细胞形态分别与明胶/海藻酸水凝胶混合制备生物墨水。透明度测试显示，S-Cell墨水均匀性最佳。流变学测试表明，所有墨水均表现出剪切稀化特性，且墨水均保持溶胶-凝胶温敏转变能力。这对形成挤出微丝单元和打印过程中的结构自支撑至关重要。在挤出测试中，S-Cell因其均匀性良好和尺寸小的优势，可用内径更小的针头（24G：310μm）进行挤出（图3）。

在此基础上，作者通过进一步测试不同规格针头（18G-24G）的打印效果发现，当针头直径能覆盖85%（临界分数）以上的细胞团时，生物墨水可以实现稳定打印（图4）。并且仅S-Cell墨水可顺利通过24G针头实现更高分辨率打印（图4）和更高细胞活性（图5）。

作者通过活死染色定量分析发现，在打印后，三种墨水细胞存活率相近，但培养4天后，S-Cell组的细胞活性提高至80%以上，且35天内持续增殖，载细胞结构保持良好形貌和结构稳定性（图5、6）。

团队使用S-Cell墨水成功打印出厘米级的“胡萝卜形状”结构。活死染色结果显示，不同区域细胞活性一致，表明3D打印构建的多孔结构有助于营养物质的均匀交换（图7）。

RNA-seq 分析显示，打印过程激活了细胞壁修复、防御响应、氧化应激等基因表达，提示植物细胞能通过自我调节应对适度的剪切应激（图8）。但若剪切力过强，细胞死亡风险加大。

总结与展望
      为避免植物细胞在打印过程中，因过高的剪切作用而导致细胞死亡和生长缓慢，本研究首次提出“临界分数”作为细胞团-喷嘴匹配的重要准则，为高分辨率与高活性植物细胞打印提供理论依据与实用指导，并通过RNA-seq分析，初步验证了在合适的剪切作用下，植物细胞可通过自调节，恢复良好的生长状态。总结而言，打印参数窗口的选择对植物细胞打印至关重要。
      论文于2025年2月5日发表于《Biofabrication》，清华大学机械系博士生周德志为第一作者，本科生李佩锡为共同第一作者，欧阳礼亮副教授为通讯作者，其他合作者包括博士生余爽、前科研助理崔镇华以及深圳清华大学研究院徐弢教授。项目获得国家自然科学基金的支持。

原文链接：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/adada1