三维打印在软骨组织工程中的应用(2)
时间：2024-03-14 09:14 来源：南极熊 作者：于淑颖 李昱 程新好 阅读：次
二、三维打印技术在关节软骨的应用
（一)关节骨软骨解剖结构和功能
骨软骨组织构造精细且复杂，在解剖结构上关节软骨与软骨下骨互相连接，具有特定的骨软骨单元结构梯度和生物学特性。骨软骨界面是一个呈连续性变化的整体，由上而下软骨组织具有不同的微观解剖结构、力学特性以及生物学特性 [ 21 ]。在微观解剖学中，关节软骨自上而下可分为3层：关节软骨层、钙化软骨层和软骨下骨层( 图2 )。其中关节软骨层包括软骨表层、中层和深层。关节软骨层又称透明软骨层，透明软骨层和钙化软骨层交界区被称作潮线，它是嵌合在软骨深层与钙化软骨层中的一个彼此交错的三维结构，将较软的透明软骨组织与较硬的钙化软骨连接在一起。钙化软骨层和软骨下骨层的交界区被称作水泥线或粘合线，将两侧结构交错结合锚定在一起。
关节软骨层主要由水、ECM(主要是Ⅱ型胶原纤维)和软骨细胞组成。胶原纤维直径和方向、各层含水量、细胞形态和种类等由软骨表层至深层逐渐发生变化。胶原纤维在软骨表层直径较细、排列密集、与关节表面相平行；在软骨中层，直径增粗、排列随意；在软骨深层，胶原纤维直径进一步增粗、与关节表面相垂直，部分来自软骨深层的粗大胶原纤维贯穿潮线将软骨深层与钙化软骨层紧紧连接。含水量在软骨表层最高，随着深度的增加逐渐降低，软骨深层含水量最低。由于含水量与渗透率呈正相关，软骨深层渗透率最低，几乎没有液体能够通过该组织，因此该层受到的界面剪切力也最大。
钙化软骨层是位于关节软骨层与软骨下骨层之间的一层钙化骨组织，是一种天然界层结构。钙化软骨层软骨细胞含量、含水量进一步降低，同时出现组织钙化。软骨的抗压模量和抗压强度从表层到深部逐渐增加，钙化软骨层形态致密，其硬度为关节软骨层的10倍，为软骨下骨层的1/60。在力学性能方面，钙化软骨层起承载多变剪切力、缓冲力以及连接作用，使得关节在运动时受的力学冲击显著降低，并且将关节软骨的剪切力转化为压应力传递至软骨下骨，大大降低了关节软骨被压碎和撕裂的可能性。另外，钙化软骨层有屏障作用，阻碍了关节软骨层与软骨下骨层之间的物质交换 [ 22 ]。
软骨下骨层由水(约10%)、透明质酸、糖蛋白(Ⅰ型和Ⅴ型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白)和矿物质成分组成。软骨下骨是高度血管化的生物矿化结缔组织，大量的透明质酸和Ⅰ型胶原纤维为软骨下骨提供了强大的抗压强度和强大的硬度，与软骨相比，软骨下骨具有更高的压缩模量和更低的弹性模量。
(二)三维打印技术方案
整体来看，关节软骨自上而下含水率逐渐降低，蛋白多糖以及钙化程度逐渐升高。正因为关节软骨有很强的层次递进性，从而导致了其具有独特的生物学特性和结构复杂性 [ 23 ]。而三维打印技术逐层组装的特点使得种子细胞、生物活性因子和生物材料在三维空间中可以精准排列分布 [ 24 ]。此外，由于软骨损伤的同时往往伴有软骨下骨的损伤，三维打印技术可用于制造具有细胞梯度及排列结构的软骨支架，因此在构建双相及多相仿生支架时具有极大优势。目前常见的软骨支架可分为离散型仿生支架和连续型仿生支架。离散型仿生支架又可分为单相支架、双相支架和多相支架等 [ 25 ]。
单相支架由一种或多种材料制备而成，具有相同结构、成分、力学属性，其单一的孔径率和机械性能无法满足关节软骨渐变的组织结构和功能变化的要求。双相支架通常具有软骨相和骨相2层结构，且各分层在成分、结构、力学性能上更加接近软骨组织结构，能够一定程度上构建软骨-骨一体化修复 [ 26 ]。Swieszkowski等 [ 27 ]使用了由纤维蛋白/PCL和PCL/PCL-磷酸三钙相组成的双相结构。这2个结构接种适当数量的细胞，分别用于软骨和骨再生的成软骨培养基和成骨培养基。最后，使用纤维蛋白胶将2个结构整合成1个构建体，可以清楚观察到软骨再生和新骨形成。但是双相软骨支架缺少了钙化软骨层，且支架置入后有支架断裂等并发症，所以三相及多相支架在软骨-骨一体化修复中有更大优势。三相及多相支架能够更好地模拟出天然软骨的分层结构及力学性能上的变化，从而构建出理想的仿生软骨。Du等 [ 28 ]使用SLS技术制备了由PCL和透明质酸/PCL微球组成的多相骨软骨支架，该仿生支架具有连续多层结构，模拟了从关节软骨层到软骨下骨层的梯度组成变化。结果表明，多相支架具有高度互连的孔隙率和理想的机械性能，以及优异的生物相容性。动物实验的体内评估进一步证实，多相支架可成功诱导骨软骨修复，新形成的组织表现出多种组织类型，包括关节软骨和软骨下骨。相较于离散型骨软骨支架，连续型仿生软骨支架显著降低了支架分离等并发症的发生，连续型仿生软骨支架可将各层成分、结构、力学性能逐渐平稳过渡，通过一体化构造增强了支架的稳定性 [ 29 ]。Gao等 [ 30 ]通过双氢键单体、N-丙烯酰甘氨酸酰胺(NAGA)和N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺(THMMA)共聚合成了高强度热响应超分子共聚物水凝胶。NAGA/THMMA共聚单体水凝胶(PNT水凝胶)显示出温度敏感的可逆凝胶↔溶胶转变和剪切减薄行为，因此可通过三维生物打印制备具有梯度成分(顶层加载转化生长因子β1，底层结合β-磷酸三钙)的连续型仿生软骨支架，所得梯度支架保持高保真度和分辨率，具有高度互连的孔隙和理想的机械性能以及优异的生物相容性。此外，这种在不同层上印刷有转化生长因子β1和β-磷酸三钙的生物杂交梯度水凝胶的支架有助于体外人骨髓干细胞的附着、扩散、成软骨和成骨分化。
三、三维打印技术在耳廓软骨的应用
软骨主要以3种形式存在于身体中：弹性软骨、纤维软骨和透明软骨。尽管3种软骨的特征都是高含水量和由软骨细胞支撑、维持，但是其富含Ⅱ型胶原和糖胺聚糖的ECM之间存在显著差异，因此每种类型的软骨都具有不同的功能。例如，位于外耳和会厌的弹性软骨具有富含弹性蛋白的ECM，该ECM为组织提供弹性，其主要功能是在重复弯曲时提供支撑，同时保持结构和形状。在耳廓弹性软骨中，由于不同部位的ECM含量分布不同，造成各部位力学性能的差异 [ 31 ]。耳软骨ECM主要由蛋白多糖和弹性纤维构成，其中耳廓软骨中央区域弹性纤维分布密集，周边区域分布稀疏，因此耳廓中的耳屏、耳轮、对耳屏、对耳轮、耳甲和耳舟等亚单位结构( 图3 )具有不同的力学性能，其中耳轮力学强度最低，对耳屏力学强度最高。耳廓软骨无血管、低浓度的细胞以及固有的不增殖特性使该软骨无法在功能、组织上自我愈合或再生 [ 32 ]。
先天性小耳畸形、耳廓外伤、耳廓术后、耳廓炎症等各种原因可导致耳廓软骨不同程度的缺损。耳廓软骨缺损可影响其生理功能、颜面美观，严重者可危及患者心理健康，因此耳廓软骨缺损修复重建对提高患者生活质量具有重要意义。耳廓软骨组织工程早在20年前已成功开展，Cao等 [ 33 ]将牛软骨细胞接种在非织造聚乙醇酸网上，用海藻酸钠模具通过溶剂浇铸工艺将其进一步嵌入聚乳酸中，从而创造了人工耳。将构建体植入无胸腺小鼠皮下，12周后它们表现出新软骨的大体组织学外观。但是通过传统工艺制造的耳软骨支架在植入体内时发生坍塌，这也是此软骨支架的致命弱点。发展与天然耳廓软骨不同解剖分区的力学性能相适应、结构精细并可长期稳定于体内的耳软骨支架，是组织工程耳软骨研究和临床转化迫切需要解决的关键问题。
三维打印技术在制备复杂形状和多种细胞类型的耳廓软骨支架中广泛应用。Xia等 [ 34 ]将明胶和透明质酸制备成水凝胶，并采用三维打印以确保外部三维形状和内部孔隙结构的精确控制；其次，将甲基丙烯酸酐和光引发剂引入水凝胶系统，以使材料在三维打印期间可光固化；最后，采用冷冻干燥进一步提高机械性能并延长降解时间。通过整合光固化三维打印和冷冻干燥技术，以明胶和透明质酸成功地制成了人耳形状的支架，与原始数字模型相比，这种支架的形状相似程度超过90%。最重要的是，与软骨细胞结合的支架在体外和自体山羊模型中成功地再生了具有典型腔隙结构和软骨特异性ECM的成熟软骨，这充分表明了光固化三维打印技术特别适合于制造具有精确、复杂、高质量、个性化的天然支架。Zopf等 [ 35 ]利用基于激光烧结的三维打印技术，以PCL作为耳廓重建的原材料，制备患者专用支架，结果显示制备的耳廓支架具有高保真度和精细微孔结构，并支持软骨再生。生物打印技术能够精确沉积生物材料、种子细胞和生物因子，且允许支架内的材料和细胞发生变化。近年来，三维生物打印技术的发展推动了耳廓软骨支架的进一步进展。Jang等 [ 36 ]以PCL和含有脂肪干细胞、软骨细胞混合物的细胞负载藻酸盐水凝胶为生物墨水，通过三维生物打印技术进行耳廓框架的精准构建，该耳廓支架具有高度的孔隙率、适当的孔径、高度增强的机械性能，以及与天然耳廓软骨相似的细胞梯度。用定量和定性方法评估体外细胞活力、增殖和分化，结果均表明，软骨细胞、脂肪干细胞在三维支架中共培养后促进软骨生成。此外，使用大鼠模型进行了体内组织学分析，显示该耳廓支架在体内存活良好、无移位、无炎症反应，并且可再生出相应区域的丰富的腔隙软骨细胞和大面积的成熟软骨。这些研究均表明，快速发展的三维打印技术使构建精细结构、与天然耳廓软骨不同解剖分区力学性能相适应的天然仿生软骨支架有望实现。
四、三维打印技术在鼻软骨的应用
鼻是人类面部最突出的器官，包括支架结构、支撑系统及外覆组织。支架结构包括骨和软骨，其由结缔组织和韧带连接到一起并发挥支撑作用。皮肤及软组织覆盖于其表面。先天性畸形、外伤、烧伤、鼻部术后均可导致鼻部软骨缺损，极大影响患者的生活质量及心理健康。鼻部软骨部分包括鼻中隔软骨、鼻翼软骨以及侧鼻软骨( 图4 )，占据鼻部的2/3。鼻翼软骨是构成鼻下部1/3的主要成分，其轮廓决定着鼻尖的固有特征，鼻翼软骨与侧鼻软骨、鼻中隔软骨之间的相互连接与鼻尖部的支撑、位置、轮廓密切相关，共同构建了鼻部重要的美学尺度。因此，鼻重建和鼻软骨再生一直是一项艰巨的挑战。过去20年中，组织工程取得了巨大进展，但大多数研究的结果都是形状不规则的软骨珠，不够精确 [ 37 ]。
在鼻软骨生物三维打印中，喷墨打印和挤出打印是最常用的技术，水凝胶作为一种含水量高的三维高分子网络，其在结构上模拟ECM，为细胞生长提供"支架"，是生物三维打印常用的墨水材料 [ 44 ]。作为载体材料，水凝胶的性质决定了生物三维打印的成败与质量，其需要具有良好的可打印性并能为细胞生长提供适宜微环境。然而，普通水凝胶的交联网络不够均匀且缺乏能量耗散机制，机械性能较差，无法成为兼顾可打印性及生物相容性的"好用"生物墨水。理想的鼻软骨支架要求具有长期的结构稳定性。为了补偿水凝胶无法保持均匀的三维结构，纳米纤维素/海藻酸钠水凝胶作为一种新型生物墨水，结合了纳米纤维素的剪切变稀行为和海藻酸钠的快速交联能力，具有强大的稳定性和整合性，目前广泛用于鼻软骨重建 [ 45 , 46 , 47 ]。Möller等 [ 46 ]应用这种新型生物墨水，基于挤出型三维生物打印技术，成功打印出鼻软骨支架。该鼻软骨支架在小鼠体内植入60 d后显示出良好的机械稳定性，并观察到糖胺聚糖产量和鼻软骨细胞增殖的逐渐增加，免疫组化显示出明显的细胞增殖和人Ⅱ型胶原沉积，证实了三维生物打印的人细胞负载水凝胶构建体中的体内鼻软骨的生成。Apelgren等 [ 45 ]同样使用纳米纤维素、藻酸盐与人软骨细胞、人间充质干细胞结合，使用三维挤出式生物打印机制造构建体(5.0 mm×5.0 mm×1.2 mm)。生物打印后立即将构建体植入48只裸鼠的背部皮下，分别在30和60 d后进行形态学和免疫组织化学检查，结果显示构建体中的人鼻软骨细胞显示出良好的增殖能力，60 d后17.2%的表面积被增殖的软骨细胞覆盖。在包含软骨细胞和干细胞混合物的构建体中，可观察到软骨细胞合成的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原含量增加。该研究表明，三维生物打印是一种有前途的人类软骨制作技术。此外，为了再现鼻软骨的多层异质结构并实现整个鼻再生，Jodat等 [ 48 ]用集成生物传感系统打印了双生物墨水的鼻状结构。该构建体由多层软质和硬质生物墨水组成，在生物相容性条件下实现气味感知，软骨细胞负载的三维生物打印软骨样结构带有电子嗅觉模拟生物传感器。由甲基丙烯酰化水凝胶和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯组成的光交联水凝胶生物墨水可以通过调节生物墨水的机械性能，形成一个机械稳定性强、生物相容度高的三维微环境，以支持软骨细胞的生长和分化。因此，可以优化由不同浓度水凝胶组成的具有硬、软机械性能的2种不同生物墨水，以模拟鼻软骨中天然ECM的机械性能，从而允许鼻软骨组织的形成。
五、未来与展望
综上所述，骨软骨组织结构非常复杂，骨软骨缺损的再生仍然是组织工程和整形外科的一个巨大挑战。目前，已经通过三维打印技术获得了软骨(关节软骨、半月板、椎间盘、耳廓、鼻)的三维模型和支架。然而，在制备各向异性软骨的功能构建体方面仍存在一些挑战。由于关节软骨、半月板和椎间盘位于人体的承重部位，因此其软骨支架需要具备一定机械强度。耳廓、鼻等软骨为防止植入后的吸收、变性和钙化，不仅需要一定的弹性，也需要一定的机械强度 [ 48 ]。在组织再生和修复期间，组分的区域梯度(如不同的细胞和生物活性分子)和结构区域梯度(如不同的孔径、微结构和材料硬度)影响细胞增殖、迁移和分化，以及构建体的机械性能。因此，探索如何制造不同的软骨结构和仿生梯度非常重要。传统三维打印技术可一定程度上模拟体内软骨的结构生理特点，但三维生物打印技术通过使用CAD/CAM技术的空间和时间控制沉积来实现外部形状、内部孔隙率、活性细胞分布的精确控制，从而为仿生软骨的制备提供更好的解决方案。但三维生物打印技术尚不成熟，需要进一步提高分辨率和准确性。当前我们应该聚焦于改进三维打印技术和支架材料，制造具有适当生物力学特性的构建体，并通过印刷来保证较高的细胞存活率和生物分子活性，才能确保仿生组织和器官的构建。软骨组织工程的发展趋势是将天然材料与合成材料相结合，以充分发挥各自的优势。目前已经成功开发许多共聚物，有望成为软骨重建的理想材料。选择具有适当生物力学特性、生物相容性和表面形态的支架是促进软骨形成的关键，科学家需要继续努力。
目前，四维打印和智能材料的出现为软骨组织工程打开了新渠道。四维打印特指对智能材料的三维打印制造。相较于传统的三维打印，四维打印增加了"时间"这一维度，它使得所打印物体的物理特性(例如形状、颜色、尺寸等)能够响应外界刺激(诸如温度、光、有机溶剂、湿度等) [ 49 ]。四维打印通过给静态打印结构赋予动态属性，在热、光、pH、水分、电和磁场等各种刺激下，打印物体的形状和(或)属性随着时间的推移会发生变化，从而可以将材料的三维打印加工拓展到复杂几何形状之外。近年来，随着智能材料和新型打印方法的快速发展，大大扩大了四维打印的范围 [ 50 , 51 ]。智能生物材料可以调节细胞行为，提供良好的组织修复和再生微环境，从而诱导软骨修复和再生。这一过程通过被动响应外源或内源性刺激，调整材料的结构和功能，以接近于天然软骨；或者通过主动提供生理生化、物理信号因子，来控制药物或生物活性因子的释放调节此过程。应用智能生物材料构建能够与细胞和生物活性因子结合的软骨组织工程支架，被认为是软骨修复和再生的有效和有前途的策略。然而，目前临床上使用的智能生物材料很少。事实上，只有5%的生命科学发现从学术环境中最终转化用于临床、新药、诊断或设备。因此，临床需求必须是开发用于关节软骨修复和再生的智能生物材料的基础。生物材料，甚至是惰性生物材料，可以改善与细胞和组织的相互作用，并通过先进的制造技术获得智能 [ 52 ]。科学家们更应该使智能生物材料与先进的制造技术(三维、四维打印技术)相结合，推进软骨组织工程的进展。
(责任编辑：admin)
中南大学:增材制备可生物
2024年二季度，中国3D打印
《Bioactive Materials》
增材制造中机器学习研究综
高性能水凝胶的3D生物打印
研究人员开创使用X射线和最新内容
选区激光熔化增材
大型聚合物3D打印
6K Additive最新
如何打造增材制造
从实验室走向生产
3D打印在口腔修复热点内容
