三维打印在软骨组织工程中的应用
时间：2024-03-14 09:14 来源：南极熊 作者：于淑颖 李昱 程新好 阅读：次
来源：《中华整形外科杂志》2024年01月 第40卷 第01期
作者单位：郑州大学第一附属医院整形外科， 郑州450000
通信作者：王喜梅，Email:tracywang@zzu.edu.cn
在过去的几十年中，软骨的再生已经取得了巨大的进展。传统构建组织工程软骨支架的技术主要包括孔剂法(或模板法)、相分离法、气体发泡法、冷冻干燥法、静电纺丝法等。软骨是异质性的，传统支架很难模拟软骨的高度各向异性结构。因此，软骨的功能再生具有挑战性。随着三维打印技术的进步，通过生物材料、细胞和活性生物分子的共沉积，使制备精细结构、梯度变化的功能性仿生支架成为可能，从而实现功能性软骨再生。该文详细阐述了三维打印技术及其在不同解剖位置(关节、耳廓、鼻)软骨再生中的应用。此外，还讨论了制备具有区域结构梯度和区域成分梯度的仿生构建体的重要性。三维生物打印、四维打印技术及智能材料为仿生组织和器官的构建带来了希望。
软骨组织工程是集材料学、细胞生物学、工程学等多学科的研究领域，随着材料科学、细胞生物学以及三维打印技术等的不断进步，近几十年来软骨组织工程也得到了飞速的发展 [ 1 ]。软骨组织工程包括支架、种子细胞和生长因子3个经典要素 [ 2 ]，该技术主要是利用自体软骨细胞或成体干细胞作为种子细胞，将种子细胞接种在具有三维多孔结构的生物可降解支架材料上，种子细胞在生长因子的指导作用下，经过适当的分化调节，形成软骨或软骨样组织 [ 3 ]。软骨支架为种子细胞的扩散和增殖提供支撑作用，也为软骨及软骨样组织的再生和重建提供有利空间，在软骨组织工程中占据至关重要的位置。理想的软骨组织工程支架材料应具有以下几个特性：(1)生物相容性，支持种植于其上的种子细胞增殖、分化、成熟；(2)可降解性，支架置入后随着时间的推移可以缓慢降解，并促进细胞产生新的软骨基质取代支架材料，以便再生软骨组织将其取代 [ 4 ]；(3)生物力学性能，能稳定维持软骨的形状，具有与要修复软骨组织一致的机械性能；(4)个性化，支架的外形应当与修复区域匹配，或易于被塑造成各种所需的形状；(5)适当的孔隙率，允许分子、营养物和氧气的迁移和扩散 [ 5 ]。
传统的软骨支架制备方法包括孔剂法(或模板法)、相分离法、气体发泡法、冷冻干燥法、静电纺丝法等，具有简便、经济等优点，但是也存在着难以灵活设计和精确调控支架的微观结构、难以个性化制造与损伤部位高度契合的支架外形、难以构建非均匀特征的支架(双相及多相支架)等缺点。近年来，三维打印技术发展迅速，在计算机辅助成型的基础上能够精准构建和调控支架的宏观外形与微观特征，形成具有良好相容性、形态和力学强度适宜的软骨仿生梯度支架，最终达成软骨及软骨样组织的个性化修复与再生 [ 6 , 7 ]。因此，三维打印技术在软骨组织工程领域中的应用有着广阔的发展前景。本文详细介绍了软骨组织工程的种子细胞、支架材料、三维打印技术，以及三维打印技术在不同解剖位置(关节软骨、耳廓、鼻)软骨再生中的应用。此外，还讨论了具有区域结构梯度和区域成分梯度的仿生构建体的制备方法，三维生物打印技术、四维打印、智能材料为仿生组织和器官的构建带来了希望。
一、三维打印技术
(一)三维打印技术的几种方式
三维打印技术是一种快速成型技术，又称增材制造，是以数字模型文件为基础，运用粉末状金属或塑料等可粘合材料，通过逐层打印的方式来构造物体的技术 [ 1 ]。通过结合CT、MRI、表面扫描和三维摄影等成像技术，利用计算机辅助设计(computer-aided design，CAD)和计算机辅助制造(computer-aided manufacturing，CAM)技术，将目标软骨形状数据转化为三维打印数字模型文件，再经由三维打印技术精确定制软骨结构外形，获得理想的组织工程软骨。常见的三维打印方式包括：熔融沉积技术(fused deposition modeling, FDM)、立体光刻法、低温沉积制造(low-temperature deposition modeling, LDM)、选择性激光烧结(selective laser sintering, SLS)、三维打印成型(three-dimensional printing, 3DP)、电子束自由成型制造(electron beam freeform fabrication, EBF)、直接金属激光烧结(direct metal laser sintering, DMLS)、电子束熔化成型(electron beam melting, EBM)、选择性激光熔化成型( selective laser melting, SLM)、选择性热烧结(selective heat sintering, SHS)等 [ 8 , 9 ]。下面主要介绍FDM、立体光刻法、LDM及SLS。
1．FDM
FDM是最常用的三维打印技术。FDM原理是在计算机精准控制路径中，高温熔融挤出聚合物材料流经喷嘴后，材料在逐层打印过程中形成适当的形状( 图1 )。FDM可以快速制造具有高度互连的孔几何结构和通道尺寸的支架。通过改变挤出压力、喷嘴直径和沉积速度等工艺参数，可以打印具有宽范围细丝直径和孔隙率的支架。FDM通常适用于聚己内酯(polycaprolactone, PCL)、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸等热塑性高分子的成型以及少数温敏材料的打印，其特点是材料加工应用灵活，打印的结构精度高、支架力学强度较为理想，可构建多种软骨支架，在三维打印中广泛应用。但由于FDM加工温度高，FDM的材料处于受热状态，细胞无法在打印过程存活，不适用于生物打印 [ 8 ]。
立体光刻法包括光固化(stereolithography, SLA)和数字光处理(digital light processing，DLP) 技术，是感光性材料经光源照射后迅速发生固化，逐层沉积，最终实现三维打印成型。立体光刻法不是基于喷嘴方式，而是液体材料位于树脂浴中，其中构建板降低并且光源跟踪编程图案仅交联设计的部分，该过程可逐层让材料沉积，直到物体成型完成 [ 10 ]，它避免了在其他技术中通常观察到的细胞上的剪切应力。SLA和DLP技术间的区别是使用的光源不同，SLA使用激光，而DLP使用来自投影的光源。激光系统逐点诱导光敏材料的选择性交联，而DLP系统使用动态反射镜阵列，选择性地将光投射到区域中，以交叉链接分配给每个层的所有点 [ 11 ]。SLA或DLP基于光敏聚合物原料，可以获得较高的结构精度和稳定性，并且SLA立体成型成熟度最高，成型速度快，尺寸精度高，适用于光敏水凝胶(如双键改性的明胶和透明质酸)构建软骨支架和生物打印。常用的感光性水凝胶材料如甲基丙烯酸化的藻酸盐、明胶、聚乙二醇等可用于软骨组织工程构建 [ 12 ]。
3．LDM
LDM在受控的冷却室的作用下，使复合浆料或溶液在沉积过程中始终保持低温状态 [ 13 ]。LDM适用于高分子浆料、混合生物材料和聚合物的打印，可实现高精度复合浆料沉积，并且可以通过冷冻干燥在材料表面形成微孔，但是LDM可能会在构建体中残留有机溶剂 [ 9 ]。
4．SLS
SLS是一种在计算机控制下进行激光扫描，以在工作平台上熔化和粘结粉末材料的技术。当一层扫描完成后，在固化层的表面涂上一层新的粉末材料，对其进行扫描并逐层粘合，以产生三维结构。SLS主要适用于金属粉末、塑料和陶瓷的打印。SLS无需使用支撑材料，加工速度快，但是持续高温可能会导致聚合物材料降解，产品表面粗糙且需要后处理，加工过程中会产生灰尘和有毒气体。因此，SLS不适用于水凝胶成型 [ 9 ]。
(二)三维生物打印
三维生物打印是众多三维打印技术中的一个分支，也是组织工程和再生医学的一种先进辅助技术手段 [ 14 , 15 ]。目前三维打印技术广泛应用于软骨支架的打印，由于材料特性以及成型条件限制，需要在软骨支架打印成型后接种种子细胞。而三维生物打印以活体细胞与支架材料为生物墨水进行同步打印，最终形成具有生理功能的组织或器官。传统三维打印技术无法精准调控接种在软骨支架上种子细胞的空间分布，所构建的微环境与体内差异大。三维生物打印弥补了传统三维打印的缺点，精细控制细胞分布以及机械、化学性质的调节，可以更好地模拟天然软骨的解剖结构及其生理功能 [ 9 , 16 ]。这开辟了许多新的视角，包括通过开发复杂结构(如骨软骨隔室)、不同类型的软骨(透明软骨、纤维软骨、弹性软骨)和根据特定患者的需要，构建个性化医疗。三维生物打印的关键要素在于生物墨水的设计，传统三维打印软骨支架时，由于没有活体细胞的存在，可选择的打印方式较多，打印条件可较为苛刻，如冷冻、加热、高强度光交联等；传统三维打印可选择的打印墨水较为宽泛，如水凝胶的水相溶液、热塑性高分子的有机溶液或熔融浆料；传统三维打印可控制的打印墨水的参数自由度较大，可最大限度提高支架材料的浓度和黏度以获取更加理想的结构成型效果。而三维生物打印由于生物墨水中活细胞的存在，为保持细胞的生物活性，可选择的打印方式较少，生物墨水的制备和打印也需避免苛刻的环境；由于水凝胶十分接近天然细胞外基质(extracellular matrix, ECM),细胞可以在水凝胶内部存活，因此水凝胶是目前制备生物墨水的最主要材料 [ 17 , 18 ]。三维生物打印成型性能(与结构相关)和细胞活性(与功能相关)对于生物墨水的特性(如黏度、强度等)有着相反的要求，前者希望生物墨水有较高的浓度、交联密度等，后者正好相反。由于单种水凝胶存在各自的缺陷，复合生物墨水体系已成为软骨生物打印的主流。目前，三维生物打印技术还处于发展阶段，适宜的生物墨水较少是限制其发展的重要原因之一，开发更多可供选择的生物墨水是目前三维生物打印技术重要的研究方向 [ 19 , 20 ]。
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