《Science Advances》：3D打印生物活性纤维增强水凝胶助力肌腱再生(2)

时间：2024-05-16 08:54 来源：EngineeringForLife 作者：admin 阅读：次

【体内蛋白质组学揭示生物活性纤维增强水凝胶促进 MTJ 再生的内在机制】

为阐明K/M@SM-PA促进MTJ再生的机制，对术后2周的再生MTJ组织进行了体内无标记蛋白质组学分析。对来自 M@SM-PA 组和 K/M@SM-PA 组的三个独立重复序列进行了测序，聚类分析后的差异表达蛋白（DEPs）热图显示，这两组之间的蛋白表达量存在显著差异（图 4A）。主成分分析（PCA）显示，每组的三个重复品都有明显的聚类（图 4B）。如火山图所示，共鉴定出 937 个蛋白质，其中有 193 个上调的 DEPs 和 553 个下调的 DEPs（K/M@SM-PA 与 M@SM-PA）（图 4C）。为深入了解这些DEPs的功能，研究人员进行了基因本体（GO）富集分析，以揭示发生变化的生物过程（BPs）、细胞成分（CCs）和分子功能（MF）。如图 4D 所示如图 4D 所示，上调的 DEPs（K/M@SM-PA 与 M@SM-PA）富集了几个与 MTJ 再生高度相关的 GO 术语，包括 BP 中的 “肌肉系统过程”、“横纹肌收缩”、“骨骼肌收缩”、“肌肉结构发育”和“骨骼肌组织发育”；CC 中的“肌球蛋白复合物”、“锚定连接”、“局灶粘附”和 “肌肉-肌腱连接”；以及 MF 中的“肌肉α-肌动蛋白结合”。这些术语大多与骨骼肌的发育和功能维持有关，表明在纤维增强水凝胶系统中加入Klotho能有效促进MTJ缺损中骨骼肌的再生，这与组织学结果一致（图2B、C、F、H和K）。对上调的 DEPs 进行的 BinGO 分析也显示了一致的结果。还发现了几个与肌肉-肌腱界面相关的 CC 术语，包括“锚连接”、“局灶粘附”和“肌腱连接”（图 4D），这可能与 MTJ 标记表达上调和肌肉-肌腱整合改善有关（图 2，D 和 I）。在这些术语中，“局灶粘附”和“锚连接”是 MTJ 的关键组成部分。它们与肌球蛋白的肌动蛋白丝相连，肌动蛋白丝附着在细胞外的层粘连蛋白上，促进了肌纤维与肌腱 ECM 的锚定。然而，可能由于缺乏足够的肌腱特征标记物，没有肌腱特异性术语被富集。为克服 DEP 富集分析的局限性，还对所有鉴定出的蛋白质进行了基因组富集分析（GSEA）。结果显示，在比较 K/M@SM-PA 和 M@SM-PA 时，多个与肌肉相关的 BP、CC 和 MF 术语发生了显著变化（图 4E），证实了 Klotho 在促进肌肉再生方面的显著作用，这与之前的报道一致。

图4 体内全局蛋白质组学揭示了生物活性纤维增强水凝胶促进 MTJ 再生的内在机制

【生物活性纤维增强型水凝胶可促进细胞存活并支持移植间充质干细胞的成腱/成肌分化】

为证实 Klotho- 加入生物活性纤维增强水凝胶对间叶干细胞存活的保护作用，在体外应用 H2O2 和 IL-1β 刺激诱导细胞氧化应激，模拟损伤 MTJ 的病理环境。采用 2′，7′-二氯荧光素-二乙酸酯（DCFH-DA）测定和定量聚合酶链反应（qPCR）来评估水凝胶系统的抗氧化活性。间充质干细胞经H2O2或IL-1β处理后，H2O2-或IL-1β处理组的ROS阳性细胞较Ctrl组（未经H2O2或IL-1β处理）显著增加，证实H2O2和IL-1β处理能有效促进ROS生成并诱导间充质干细胞氧化应激（图5A和B）。代表性图像和定量分析显示，H2O2/IL-1β + K@SM-PA 水凝胶处理的间充质干细胞在 H2O2- 和 IL-1β 诱导的 ROS 模型中的 ROS 阳性细胞率分别为 11.71 ± 0.77% 和 23.02 ± 7.63%，明显低于 H2O2/IL-1β 处理的间充质干细胞（H2O2-94.15±1.56%，P＜0.0001；IL-1β为96.67±0.68%，P＜0.0001）和H2O2/IL-1β+SM-PA水凝胶（H2O2为86.05±5.86%，P＜0.0001；IL-1β为96.91±1.93%，P＜0.0001）（图5A和B）。

qPCR结果显示，H2O2刺激后，超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、锰依赖性超氧化物歧化酶（MnSOD，又称SOD-2）和过氧化氢酶（CAT）的表达水平在H2O2组和H2O2+SM-PA组明显升高（图5C至E），表明间充质干细胞受到的氧化应激增加，激活了其内在的抗氧化防御系统。这与之前的一项研究一致，该研究用各种促氧化剂（包括 H2O2、百草枯和甲萘醌）处理 C2C12 肌肉细胞系，发现 C2C12 细胞会激活抗氧化防御系统以应对氧化应激，表现出几种抗氧化酶的表达显著增加，包括 MnSOD、CAT、Cu/Zn-超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶。相比之下，与 H2O2 组和 H2O2 + SM-PA 组相比，H2O2 + K@SM-PA 组的间充质干细胞在 Klotho 处理后受到的氧化应激水平较低（图 5C 至 E），SOD-1、SOD-2 和 CAT 的表达明显降低就是证明。这些结果表明，负载有 Klotho 的纤维增强水凝胶具有显著的抗氧化生物活性，能有效清除病理微环境中的 ROS。

图5 生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激提高细胞存活率并支持间充质干细胞分化

【生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激维持肌母细胞和肌腱干细胞的表型】

本研究的体内蛋白质组学数据显示，K/M@SM-PA水凝胶可以抑制氧化应激和炎症反应，从而维持内源性和外源性细胞的表型和功能，启动MTJ的再生过程（图4）。除了移植的间充质干细胞外，MTJ 内的常驻细胞群也能对生物活性纤维增强水凝胶改善的微环境做出反应，从而启动 MTJ 再生的细胞过程。鉴于生物活性纤维增强水凝胶对移植间充质干细胞的抗氧化作用已得到证实，本研究将评估范围扩大到分别代表肌肉和肌腱组织内细胞的 C2C12 细胞和肌腱干/祖细胞（TSPCs）（图 6A）。同样，C2C12和TSPCs受到H2O2和IL-1β的刺激，并进行DCFH-DA检测以评估细胞内的ROS。当用 H2O2/IL-1β 和 H2O2/IL-1β + SM-PA 处理时，C2C12 和 TSPCs 表现出的 ROS 阳性细胞数量明显高于对照组，证实了这两种细胞中氧化应激的成功诱导（图 6B 至 E）。研究发现，与 H2O2 + SM-PA 组相比，H2O2 + K@SM-PA 组的两类细胞的 ROS 生成量都大大降低（图 6B 和 C）。C2C12（1.77 ± 1.26% 对 17.44 ± 2.78%，P < 0.05）和 TSPCs（4.66 ± 2.11% 对 55.27 ± 9.93%，P < 0.0001）中的 ROS 阳性细胞率均有所下降（图 6F 和 G）。此外，在IL-1β刺激模型中，在C2C12和TSPCs中也观察到了类似但更显著的效果，与SM-PA水凝胶相比，K@SM-PA水凝胶中C2C12（1.42±0.61%对22.33±3.76%，P＜0.001）和TSPCs（3.80±2.01%对67.28±7.53%，P＜0.0001）的ROS阳性细胞率显著降低（图6D、E、H和I）。这些结果共同证实了所开发的纤维增强水凝胶对肌肉和肌腱系细胞具有很强的抗氧化能力。

图6 生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激维持 C2C12 和 TSPC 的功能表型

【生物活性纤维增强水凝胶引导巨噬细胞从促炎表型极化为抗炎表型】

本研究采用了常用的 M1 型巨噬细胞极化诱导剂脂多糖（LPS）（图 7A）。IF 染色显示，与 Ctrl 组相比，LPS 刺激可显著上调巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）（M1 标志物）的表达水平（P < 0.01），而 CD206 和精氨酸酶-1（ARG-1）（M2 标志物）的表达则明显下降，证实了 LPS 诱导后巨噬细胞的 M1 极化（图 7B 至 E）。与 LPS 组（P < 0.05）和 SM-PA 组（P < 0.05）相比，K@SM-PA 组的 iNOS 蛋白表达水平大幅下降（图 7B 和 E）。相反，与 LPS 组和 SM-PA 组相比，K@SM-PA 组 M2 标志物（CD206 和 ARG-1）的蛋白表达明显升高，如图 7（C 至 E）所示。与此相一致，本研究发现 K@SM-PA 水凝胶可部分减轻 LPS 刺激后 CCR-7 表达的增加，而 SM-PA 水凝胶则不能（图 7F）。同时，与 LPS 组（P < 0.05）和 SM-PA 组（P < 0.05）相比，K@SM-PA 水凝胶诱导的 CD206 表达量明显增加（图 7F）。IL-10的表达也有类似的趋势，但没有显著差异（图7F）。总之，这些结果表明，Klotho负载的纤维增强水凝胶通过引导巨噬细胞从M1表型极化到M2表型发挥了抗炎作用。

图7 生物活性纤维增强型水凝胶引导巨噬细胞从 M1 表型极化到 M2 表型

本研究开发了一种纤维增强水凝胶，它能为力传导提供足够的机械支持，同时具有免疫调节和抗氧化生物活性，以改善具有挑战性的损伤后微环境，最终调节外源性和内源性细胞的行为，促进体内 MTJ 的结构和功能再生（图 8）。3D打印的 PLGA 支架的排列结构使水凝胶系统具有接近于原生 MTJ 的强大机械性能，可有效支持肌肉-肌腱界面的力传递，从而维持 MTJ 再生过程中的生理功能。在水凝胶系统中加入 Klotho 可减轻氧化应激和炎症反应，从而创造一个有利于再生的微环境，保护 MTJ 损伤中各种细胞群的功能和表型。它能提高移植间充质干细胞的存活率，并支持其多向分化能力，可能有助于在随后的肌肉和肌腱再生过程中增强肌源性/腱源性分化。此外，改善的微环境还能维持 MTJ 中常驻肌腱/肌肉细胞的功能表型，并调节巨噬细胞向抗炎表型的极化。

图8 促进 MTJ 再生的生物活性纤维增强水凝胶示意图

2. 总结与展望
本研究开发了一种生物活性纤维增强水凝胶，它具有足够的机械强度、抗氧化和免疫调节生物活性、干细胞递送特性和内源性细胞调节功能，可同时促进MTJ的结构和功能再生。在这种水凝胶系统中，带有排列整齐纤维的3D打印聚乳酸（PLGA）支架赋予了水凝胶足够的机械强度，以维持 MTJ 的生理功能。由于 Klotho 的加入抑制了氧化应激，该支架为移植间充质干细胞的存活和分化提供了有利的微环境，同时保持了 TSPCs 和肌母细胞的功能表型特征，从而启动了 MTJ 的再生过程。此外，它还具有免疫调节功能，能使巨噬细胞从促炎的 M1 表型恢复到抗炎的 M2 表型。与以往主要在体外进行的 MTJ 组织工程研究不同，本研究定制了一个优化的细胞微环境，以调节体内不同的细胞群，从而增强 MTJ 的结构修复和功能恢复。本研究获得的启示为未来治疗 MTJ 损伤带来了巨大希望。

文章来源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adm7164

(责任编辑：admin)

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