脱细胞椎间盘水凝胶对人骨髓间充质干细胞的组织特异性分化和再生研究(2)

时间：2022-03-31 09:09 来源：生物打印与再生工程作者：admin 阅读：次

从上面的分析可以看出，DAF-G 2D培养能抑制YAP1磷酸化从而提高它的活性。相反地，DNP-G 3D培养不仅能促进YAP1磷酸化(从而降低其活性)，还使YAP1从细胞核转移到细胞质(图6a-c)，并伴随其目标蛋白质的下调。为了进一步确定YAP1在NP分化中的重要作用，研究人员发现当YAP1活性被抑制时，NP标志物(GPC3和其他)的表达显著提高(图6d-e)，说明抑制YAP1能够促进hBMSCs向NP细胞分化。而当研究人员以转染方式过表达YAP1时，发现GPC3和其他NP标志物的表达均下降了(图6f-g)。所以，YAP1磷酸化(即活性抑制)及其向细胞质转移促进了hBMSCs向NP细胞分化。另一方面，DAF-G 2D培养时，YAP1的表达水平(细胞核内)最高而磷酸化YAP1(p-YAP1)的表达水平低于其他组(图6h-j)，而且转录水平也提高了。进一步地，当YAP1活性被抑制时，研究人员发现AF标志物表达水平被下调了(图6k-i)，说明抑制YAP1活性能阻碍hBMSCs向AF细胞分化。而当YAP1过表达时，AF标志物TNMD的表达被上调了，说明YAP1的表达上调及其向细胞核转移导致了hBMSCs向AF细胞分化。

研究人员对YAP1的核质分布也进行了分析，认为YAP1在DAF-G 2D的核内聚集的原因除了培养方式还有机械因素(DAF-G的储能模量高于DNP-G)。转录组RNA测序显示低模量会伴随YAP1的退化，表明较软的基底能增加NP细胞表型。除了机械因素，DTM的组成差异也能影响YAP1的胞内分布。例如，存在于DAF-G中的 TGF-β1能够通过PI3K/Akt信号通路调控YAP1活化，而YAP1目标基因亚型主要取决于内源TGF-β1信号通路。因此，DAF-G 2D中TGF-β1高表达有助于YAP1的活化。另一方面，存在于DNP-G中的FGF-2在低浓度时能够诱导YAP1向细胞核聚集，而高浓度时则能激活Hippo通路并促进YAP1失活。

图6 YAP1对hBMSCs组织特异性分化的相反调控效应

5.DTM水凝胶的组织特异性修复
为了考察DNP-G是否能够更好地治疗NP退化疾病，研究人员将不同水凝胶注射到大鼠模型中NP退化的病变部位。受伤NP组织的修复程度通过术后4周和8周的病理学和形态学分析进行评价。MRI表征显示DNP-G能更好地保持NP组织的完整性(图7a)，而水含量定量分析和普菲尔曼分级显示DNP-G具有最佳的修复效果(图7b-c)。H&E和S&O染色表征显示DNP-G显著减轻了NP组织的形态学恶化(图7d-e)。X-ray结果显示DNP-G组中椎间盘高度能更好地维持，显著减轻了椎间盘窄化的不良现象(图7f)。COL1A1和COL2A1的免疫组化染色显示8周时DNP-G组中的COL2A1阳性染色面积明显大于其他组(图7g)。上述结果说明DNP-G能够有效地修复受伤的NP组织并阻止其退化。

另一方面，研究人员采用大鼠AF缺陷模型评估了DAF-G的组织特异性修复功能。MRI表征显示DAF-G具有最高的T2加权信号、水含量和最低的普菲尔曼评分，说明椎间盘退化被显著延迟了。H&E和S&O染色表征显示，DAF-G和DNP-G组的椎间盘组织在术后4周时没有出现退化形态，而对照组则出现了低细胞存活量、低蛋白聚糖含量和不规则的ECM分布(图8a)。术后12周，DAF-G组的退化得到了更大程度上的减轻，而且残留AF胶原取向性较好(图8a)。COL1A1染色显示，相比于DAF-G组，AF缺陷在DNP-G和NS组仍然明显，说明DAF-G能更好地连接周围组织。另外，DAF-G组的COL2A1阳性染色面积明显大于其他组(图8b)。定量组织学分级表征显示，DAF-G组中的损伤椎间盘的修复程度最高。总之，这些结果表明组织特异性的DTM水凝胶能够在体内修复他们对应的组织损伤和缺陷。

图7 DNP-G特异性修复NP组织

图8 DAF-G特异性修复AF组织

总结
在这篇论文中，研究人员对利用椎间盘两块相邻但不同的组织系统研究了DTM水凝胶对干细胞行为(分化)的组织特异性影响。主要结论包括三点：①DNP-G和DAF-G诱导hBMSCs分别向NP和AF细胞的组织特异性分化取决于细胞的天然ECM组成和空间特征；②调控整合素介导的RhoA/LATS /YAP1信号通路能够决定hBMSCs的命运；③DNP-G和DAF-G能特异性地体内修复对应组织损伤和缺陷。研究人员还指出，基于水凝胶材料强大的可塑性，生物3D打印、静电纺丝、相分离和其他加工方法都可被用来构建NP和AF空间结构并保留功能性ECM组成，从而为修复退化NP和AF组织提供有效的治疗策略。

参考文献
Y. Peng et al., Decellularized Disc Hydrogels for hBMSCs tissue-specific differentiation and tissue regeneration. Bioactive Materials 6, 3541-3556 (2021). DOI：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.03.014

(责任编辑：admin)

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