顶刊综述：再谈“生物3D打印-从形似到神似”
时间：2020-03-03 10:55 来源：南极熊 作者：中国3D打印网 阅读：次
EFL团队在18年发表的综述论文上，特别阐述了“生物3D打印-从形似到神似”的观点。近两年，随着生物3D打印的发展，涌现了很多以生物功能为目标的研究工作。为此，很多团队系统总结了生物3D打印技术的最新进展，例如，2019年4月，哈佛医学院Yu Zhang教授在Small上发表的“3D Bioprinting: from Benches to Translational Applications”综述文章，以及2020年2月，乌得勒支大学Jos Malda教授在Advanced Materials上发表的“From Shape to Function：The Next Step in Bioprinting”综述文章。在此，笔者期望通过这两篇综述论文，结合EFL团队的思考，再次梳理下生物3D打印从“形似”到“神似”的研究进展。
内容概览
一、“形似”研究进展生物墨水是成功打印组织和器官结构的关键和基础。一般来说，生物墨水应该兼具可打印性和生物相容性。可打印性指生物墨水适合制造具有高结构完整性和保真度的3D结构，而生物相容性表示生物墨水对细胞友好，并支持细胞粘附、增殖和铺展。围绕这个目标，生物3D打印研究初期，主要是选用生物水凝胶作为打印墨水，包括天然水凝胶和合成水凝胶。接着将通用增材制造原理应用于载细胞的水凝胶打印，开发出了多种生物3D打印方法，包括：光固化生物3D打印、喷墨生物3D打印、激光直写生物3D打印、挤出式生物3D打印机以及电纺丝生物3D打印（如图1），这些方法都有其独特优势、局限性以及适用范围，这里不再赘述。
图1 典型的生物3D打印技术：（A）光固化生物3D打印；（B）喷墨生物3D打印；（C）激光直写生物3D打印；（D）挤出式生物3D打印机；（E）电纺丝生物3D打印
生物3D打印的“形似”研究，主要围绕以构建高保真度结构为目标的生物墨水及打印策略设计。鉴于此，以材料适用范围最广的挤出式生物3D打印方法为例，重点介绍基于此目标的墨水及打印方法设计策略。具体可分为聚焦墨水设计的策略：新的化学交联思路、调节流变性能；以及聚焦重新设计墨水环境的打印策略；同轴/微流控打印、支撑浴悬浮打印。
1.新的化学交联思路：精确控制墨水的交联过程对于获得具有高的形状保真度至关重要。一种策略是通过采用阶梯生长反应来控制交联的化学过程，例如基于硫醇-烯阶梯生长反应机理，对明胶进行的烯丙基改性得到GelAGE。相比于酰化改性得到的GelMA，GelAGE表现出更快的反应速率、更均匀的网络结构（图2A）。另一种策略是通过控制交联时间来保证形状保真度，典型的例子是原位光交联策略，将墨水吸入透光玻璃毛细管在挤出前进行光交联，挤出后可保持较好的微丝形态（图2B）。此外，使用可见光引发剂（如LAP、Ru/SPS）代替紫外光引发剂（2959）也是一种既可提高交联速度有能改善细胞活性的策略（图2C）。
图2 新的化学交联思路：（A）阶梯生长反应得到的GelAGE与普通化学交联的GelMA对比；（B）原位光交联策略；（C）紫外光改为可见光引发策略
2.调节流变性能：调节墨水流变性能是一种常用的实现高形状保真度的策略。早期的方法是通过增加聚合物浓度或者添加流变改进剂实现。近期已开发出诸如逐步交联、添加纳米材料、以及构建胶体墨水等策略。逐步交联策略指两种或两种以上不同交联方式的逐步交联过程，执行第一交联步骤来调节墨水的流变特性，然后引入第二交联步骤以确保结构的长期稳定性（图3A）。另一种策略是在墨水中添加纳米硅酸盐，提高剪切变稀性能，同时诱导自我修复，提高形状保真度（图3B）。此外，近期出现了一种新的胶体墨水（将水凝胶加工成稳定的、交联的微凝胶混合体系），凝胶颗粒之间不断增加的物理相互作用导致整体流变特性从粘度主导转变为弹性主导的粘弹性行为（图3C）。
图3 调节流变性能：（A）逐步交联策略；（B）纳米材料辅助打印策略；（C）构建胶体墨水策略
3.同轴/微流控打印：同轴挤出通过使用同轴组装的喷嘴，可以同时同心沉积不同材料，从而形成双层或多层纤维(图4A、B)。与普通的挤出方式相比，同轴挤出中的交联剂和墨水溶液的空间分离允许使用较低粘度的墨水，同时保持高的形状保真度。同轴系统非常适合于海藻酸盐及其混合物的打印（氯化钙作为交联剂）。此外，通过将海藻酸盐与钙溶液共打印来产生可灌注的血管结构，同轴挤出为大组织的营养供给提供了有前途的解决方案(图4C)。微流控系统可以在微尺度上精确操纵液体行为，可实现不同墨水的快速无缝切换(500ms)，这使得该方法成为通过改变不同材料的沉积时序来构建渐变结构的有效工具(图4D)。
图4 同轴/微流控打印：（A、B）同轴打印策略；（C）EFL团队提出的同轴打印构建血管网络；（D）微流控辅助打印梯度结构
4.支撑浴悬浮打印：基于挤出打印将生物墨水在支撑浴材料内沉积，利用支撑材料提供的中性浮力和空间约束，生物墨水可以很好保持形状。通过消除重力和表面张力，能够打印其他挤出方式不可能处理的低粘度墨水（图5）。除了提高分辨率外，该方法还可以使打印的组织在潮湿的环境中保持长期稳定性，减小制造过程中细胞损伤。支撑浴材料的关键挑战在于要具有可控流变特性的非牛顿流体行为（当喷头运动对支撑浴产生剪应力时，它必须局部液化；当剪应力消失后，它的粘度需要增加，以固定住墨水并支撑复杂结构的制造）。此外，支撑浴材料还应该是细胞相容的，易于去除，以及不能干扰墨水的交联。
图5 支撑浴悬浮打印
二、“神似”研究进展
越来越多的生物打印策略为构建复杂结构提供方案，然而，解剖结构的高保真生物打印方法并不能确保获得天然组织的功能。当细胞和材料的空间沉积得到很好的控制以后，生物结构将需要经历成熟、形态形成等发育过程，这已被定义为生物打印过程的一个组成部分。然而，到目前为止，证明生物打印在组织水平上对生物功能进化具有优势的研究例子仍然有限。其中一个原因是，专注于材料和工艺开发的研究经常停留在概念验证，但没有明确说明打印在最终功能应用方面的优势。
虽然构建全功能的组织所需的确切相似度尚不清楚，但越来越多的证据表明，根据细胞和材料组成以及多个成分之间的相互作用来控制打印结构的形状对于缩短工程组织和天然组织之间的差距至关重要。因此，生物3D打印的“神似”研究，主要围绕以诱导细胞和组织功能为目标的生物墨水及打印策略设计，包括功能性生物墨水开发、细胞来源匹配、以及新的打印策略设计。此外，还提出了生物打印与细胞自组装协同策略。
1.功能性生物墨水开发：与简单添加生物活性化合物不同，一种更有效的方法是使用天然模板作为生物墨水。通过脱细胞和溶解来自脂肪、软骨和心肌组织的ECM，已经获得了可打印的、细胞相容的dECM墨水。利用体内常驻细胞分泌的细胞外基质，可更好构建细胞微环境，促进细胞生存、粘附、扩散、增殖、迁移、分化，以及组织形成和修复。基于dECM墨水，已成功诱导特定组织生长，包括软骨、心肌、脂肪和肝脏组织（图6）。此外，生物墨水设计中还需添加多肽、蛋白等细胞所需活性物质，可控释放的活性载体物质，以及诱导具有电生理特性组织再生的导电物质等。
图6 基于dECM墨水打印功能性组织结构
2.细胞来源匹配：生物打印通常被定义为“利用3D打印技术操纵含有活细胞的材料”，因此，生物打印功能化的关键之一在于细胞的选用。生物打印的细胞来源包括：骨髓干细胞（MSCs）、脂肪干细胞（ASCs）、羊膜脐带干细胞（AFSCs）等专能干细胞，胚胎干细胞（ESCs）、诱导多功能干细胞（IPSCs）等多能干细胞，以及患者自体细胞（图7A）。根据所需的组织类型，相应地选择细胞，并为其提供最佳的微环境，使其能够增殖、扩散、分化。研究表明干细胞显示出构建特定功能结构的高潜力，结合复杂结构、梯度结构、以及复合结构，可实现生物3D打印组织特定功能的重建（图7B-I）。
图7 （A）细胞来源类型；（B-I）不同细胞打印应用
3.新的打印策略设计：为了获得用于临床应用的仿生组织，不仅需要功能性生物墨水和细胞源，而且需要将这些元素整合到更新的打印策略中，以进一步实现生物打印的功能化。近几年，出现了以功能实现为目标的新的打印策略，包括高精度打印、定向结构打印、梯度/多材料打印、血管网络打印、原位打印、4D打印。
1）高精度打印：为了体外构建在细胞功能诱导上起关键作用的微/纳结构，需要提高生物打印技术的分辨率（图8A）。将传统静电纺丝与3D打印结合产生的电纺丝生物3D打印技术，可以实现300nm纤维的打印（图8B-D）。此外，高精度纤维与水凝胶复合，可以产生协同增强效果，有利于组织再生（图8E-H）。
图8 高精度打印：（A）传统挤出得到的低分辨率结构；（B-D）电纺丝生物3D打印；（E-H）电纺纤维/水凝胶协同增强
2） 异质结构打印：许多组织的功能归功于它们的各向异性结构，例如，神经网络中的信号传递，肌细胞束的力驱动，骨骼承受机械负荷的能力，都是由细胞及其细胞外基质显示的分层排列和优先方向性驱动的。因此，通过打印及墨水策略的特殊设计，进行各向异性结构的可控打印，可促进定向组织的功能化（图9）。
图9 异质结构打印
3）梯度/多材料打印：组织功能与不同类型细胞的持续相互作用以及组织界面紧密相关，例如，骨-软骨界面、韧带-骨界面。通过自混合打印喷头设计来调节两种生物墨水的体积比，可获得具有连续梯度的组织结构（图10A）。通过将不同材料墨盒与单喷头挤出系统或光固化系统集成，可实现不同墨水的快速连续切换（图10B、C）。
图10 梯度/多材料打印：（A）基于混合喷头打印梯度结构；（B）多材料挤出式打印；（C）多材料光固化打印
4）血管网络打印：血管网络打印是组织功能化的关键一步，打印策略设计的难点在于如何在生物组织打印过程中引入血管网络。目前方法主要包括将多材料打印与血管化策略相结合（图11A），基于支撑浴悬浮打印牺牲墨水并将支撑浴转变为3D基质（图11B），以及开发多隔室的墨盒（图11C）。
图11 血管网络打印：（A）集成多材料和血管化打印策略；（B）支撑浴悬浮打印策略；（C）多隔室墨盒策略
5）原位打印：跟传统的打印后再移植的思路不同，原位生物打印提供了一种将组织沉积在需要位置的新思路。原位打印依赖于在缺损中放置可以与周围内源性组织相容并诱导血管新生的组织类似物。目前策略包括集成3D扫描仪的打印系统（图12A）以及手持式生物打印设备（图12B），主要用于皮肤、软骨缺损的修复。
图12 原位打印：（A）集成3D扫描仪的打印系统；（B）手持式生物打印设备
6）4D打印：自然组织的独特功能往往是由外界刺激引起的组织构象的动态变化形成的。例如，心脏规律跳动调节全身血液循环，是由副交感神经系统控制，并由电刺激下的心肌收缩驱动。4D打印是在3D打印的基础上发展起来的，打印的结构可在外部刺激下随时间改变其结构。通常是在墨水中添加具有特殊响应的功能材料实现的（图13）。
图13 4D打印
4.生物打印与细胞自组装协同策略：事实上，在生物制造技术兴起之前，融合发育生物学和工程学的发育工程技术（细胞自组装）已成为推进组织工程发展的新模式。其主要特征是从与体内连续发育阶段相对应的顺序子过程中进行体外过程设计，这些子过程遵循细胞分化和组织生长的渐进协调发展。自组装的多细胞模块形成是该技术的关键一步，但是如何能够以受控的方式将中间模块组装成更大的组织单元是个很大的挑战。因此，生物打印和细胞自组装技术协同开发，可以极大地促进工程组织的功能化。这可以通过两种不同的方式实现(图14)。其一，生物打印可以施加特定的结构设计，允许祖细胞被打印成类器官结构，并产生诱导进一步自组织的条件，形成更大功能组织结构的潜力。其二，祖细胞悬浮液可以自组织成亚毫米到毫米级的结构，然后，这些只包含中等复杂性的结构可以被生物打印成更复杂的组织和器官，其几何形状和图案可用于指导功能组织的形成。
图14 生物打印和细胞自组装技术协同策略
目前通过生物墨水、打印技术、以及多种组织工程方式融合等解决复杂问题的工程方法，在生物打印功能化上取得了一些进展。但是，复杂的工程系统（例如汽车、飞机或计算机）是可知的，可以通过定义的规则完全理解，并通过衍生的方法来处理它们，然后可以完全预测它们的行为。相反，由于存在太多的未知变量相互作用，复杂的生物系统不是完全可知的。我们不能只通过用于复杂工程系统的策略来处理它们，但可以通过观察和研究生物系统如何发展和进化的，来获得一些理解。此外，随着生物医学研究的不断进步，与复杂生物系统相关的新的机制也在不断被发现。未来，对组织/器官再生过程中潜在的自组织机制的认识和应用，将是功能性生物组织成功打印的关键。
参考文献：
[1] 贺永, 高庆. 生物3D打印-从形似到神似.浙江大学学报, 2018.
[2] Riccardo Levato, Tomasz Jungst, Ruben G. Scheuring, et al. From Shape to Function: The Next Step in Bioprinting. Advanced Materials, 2020.
[3] Marcel Alexander Heinrich, Wanjun Liu, Andrea Jimenez, et al. 3D Bioprinting: from Benches to Translational Applications. Small, 2019.
(责任编辑：admin)
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