清华BRE团队AFM:载细胞微凝胶双相生物墨水的3D生物打印
本文第一作者为清华大学机械系生物制造中心博士后方永聪,通讯作者为清华大学机械系生物制造中心的熊卓副教授、张婷副研究员。本研究得到了清华大学人才引进启动经费基金(53330200321),国家重点研发计划项目(2018YFA0703004),国家自然科学基金面上资助项目(31771108),中国博士后科学基金站前资助项目(2021TQ0184)等项目支持。
背景介绍
3D生物打印技术因其能够将细胞和材料(如生物墨水)精确地堆积到三维复杂结构中而引起了人们的极大兴趣,该技术在体外生物系统工程中常用于构建病理模型和组织再生。目前已发展了多种生物打印技术,其中,最常见的方式是挤出式生物打印——通过数字化设计控制生物墨水的挤出与组装,然后迅速成型以保持打印结构的保真度。用于挤出式生物打印的生物墨水需要同时满足可打印性和功能性,但这通常来说是矛盾的,即浓度较高、粘度较高的生物墨水更有利于微丝挤出和结构稳定,从而获得较高的形状保真度,而浓度较低、密度较低的聚合物网络更有利于细胞的扩散、迁移和增殖。近年来为解决这些问题,国内外的研究者们提出了很多的方法,诸如使用细胞团来制造复杂的组织结构、添加流变改性剂提高初始粘度较低的水凝胶生物墨水的可打印性、添加细胞相容性明胶提高打印能力、使用悬浮打印技术扩大打印窗口等,但同时也面临着机械性能较差、生物相容性差、生物墨水种类受限、残留影响打印结构等问题。
因此,BRE团队开发出一种载细胞微凝胶双相生物墨水,能够在不同聚合物浓度的水凝胶中进行3D打印。MB墨水由两部分组成:(ⅰ)
由载细胞微凝胶充当的分散相,(ⅱ)
由水凝胶前驱体充当的连续相。MB墨水在打印过程中具有优异的流变性能,打印的结构在交联后也具有极好的结构稳定性。相较于纯水凝胶、纯微球生物墨水(jammed
microgel,
简称JM),MB生物墨水表现出超弹性和更好的循环拉-压性能。此外,通过在连续相内加入不同类型的细胞,在打印的微丝结构内能够形成异质细胞微环境。MB生物墨水的提出,为扩展现有生物墨水的应用范围开辟了新的途径,也为组织工程应用及生物医学应用提供了新的思路。
1. MB生物墨水的制备与3D打印
本研究开发的MB生物墨水由两部分组成:(ⅰ) 载细胞微凝胶在紧密堆积下作为分散相,形成了MB生物墨水的第一级网络; (ⅱ) 水凝胶前驱体作为连续相渗入微凝胶之间的空隙,在微凝胶之间形成第二级网络。使用5%甲基丙烯酰化明胶(GelMA)制备MB生物墨水进行测试,其中微凝胶使用了带有红色荧光标记的GelMA,连续相使用了绿色荧光标记的GelMA,通过荧光显微镜观察拍照,发现连续相能够按预期填充在微凝胶之间的空隙中,比较红绿的面积得到微凝胶和连续相在墨水中所占的比例(图1c 微凝胶平均直径约175μm,占比80%)。MB墨水制备方法:(ⅰ) 将载细胞的水凝胶前驱体注入微流芯片件中,被连续的油相剪切形成微凝胶,并在之后的通道/步骤中交联成形;(ⅱ) 通过一系列“注液-离心-去除多余液体”的方式,将微凝胶之间的空隙替换为所需要的水凝胶前驱体。为平衡微凝胶中的细胞活性和微凝胶的结构稳定性,使用5.0wt% GelMA载C2C12细胞进行测试,以80mW/cm2光照强度交联35s,微凝胶中的细胞活性约为91.5%±4.2%。在微凝胶中使用Brdu染色标记增殖细胞,细胞增殖率从≈30%(Day1)提高到69.8%±8.5%(Day11)。通过F-actin染色能够观察到C2C12细胞在微凝胶外表面迁移扩散。通过微流控方式能够使用多种材料、大小和细胞密度来制备载细胞微凝胶,为进行验证,本研究制备出了细胞密度高达5×107/mL的微凝胶。
使用载C2C12的MB生物墨水进行打印实验,其中微凝胶直径203.5±14.8μm,打印的微丝直径535±35.2μm。通过改变离心过程的离心力可以调节微凝胶的压实情况,但对微凝胶中的细胞活性会造成影响,在270G和500G离心力下生成的MB生物墨水,其细胞活性分别为80.3%±3.6%和73.3%±3.4%。在打印和二次交联后,受剪切力和光照影响,微凝胶中的细胞活性由91.5%±4.2%下降为62.8%±7.4%。尽管打印后的C2C12初始活性相对较低,但随培养时间的延长,细胞的生长速度较快,从D1到Day13,微丝内的细胞增殖率增长了十余倍,同时,在Day7时细胞活性>95%。在Day10-14,C2C12迁移至微凝胶外表面,进一步渗入微凝胶之间的空隙。
2. MB生物墨水的流变性能
使用5.0wt% GelMA制备MB墨水、纯GelMA墨水、JM墨水测试流变性能。三种墨水在室温下均表现出剪切稀化性质。在温度测试方面,纯GelMA墨水会随温度的升高出现凝胶-溶液的转变,JM墨水不受温度影响,MB墨水在4-35℃范围内也始终保持凝胶状态,因此,相比于纯GelMA墨水,MB墨水在一定程度上摆脱了温度的限制,拓宽了打印窗口。
考虑MB墨水微凝胶含量(M.F.≈80%/85%/95%)对于流变性能的影响,三组墨水均表现剪切稀化性质,但墨水的粘度和屈服应变会随M.F.的增加而增大,表明在更密实的堆积情况下,需要更大的应变来破坏微凝胶之间的连接,同时墨水在4-37℃条件下均能表现自愈合性质。
考虑MB生物墨水受连续相的各种交联策略的影响,分别使用PBS、海藻酸钠和GelMA作为连续相,均表现出剪切稀化性质和应变屈服性质,因此MB墨水流变性能取决于微凝胶堆积的密实情况,而与微凝胶的组成和连续相无关,但连续相会影响打印结构的结构稳定性和力学性能。
使用低浓度GelMA(3.75wt%)和海藻酸钠(0.5wt%)制备微凝胶,其中3.75wt% GelMA微凝胶在PBS溶液中能够保持长期的稳定,细胞活性为67.5%±9.1%,0.5wt%海藻酸钠微凝胶内的细胞活性为85.3%±6.4%,将两种微凝胶与GelMA连续相混合制成的MB墨水也能表现出类似的剪切稀化性质和应变屈服性质,可作为墨水用于挤出式生物打印。
3. MB生物墨水的可打印性
为验证MB生物墨水的可打印性,使用内径510μm的喷嘴(21G)进行悬空挤压,微丝直径接近喷嘴,挤出3厘米后才因重力而断裂。MB墨水由于阻力较小,在打印过程中能够实现均匀挤出,而JM墨水在打印过程中出现堵塞和不连续的问题。对打印参数进行优化后,打印了15.0×25.0mm2的多层网格,相邻层之间连接较好。在打印的双环结构中可以观察到打印丝的颗粒形态。由于MB墨水流变特性不受温度影响,喷嘴温度在15℃-30℃的范围内进行打印时,都不会影响打印的保真度,有利于在温度不稳定的极端环境条件下进行多材料3D打印和生物打印。
使用MB生物墨水打印标准管状结构来定量评估形状保真度,交联后测量打印结构的内径(I.D.)、外径(O.D.)和高度,它们略小于设定值(<5%)。使用纯GelMA生物墨水、MB生物墨水和JM生物墨水打印了直径为10mm的半球,将打印出来的半球投影在玻璃表面,形成一个完整的球体,通过Image J软件测量其直径和圆度。MB生物墨水打印的半球显示出更平滑的层间过渡,更接近设定值(如直径和圆度),表明MB生物墨水提供了更高的结构保真度。
在复杂结构方面,打印了厚血管、半月板、鼻子、耳朵和支气管等具有挑战性(悬垂、薄壁、分支等)的结构。同时也使用悬浮打印的方式打印了大脑模型,表面显示出了典型的折叠和褶皱区域,与数字模型进行对比,误差在0.5mm的比例约为94.6%。此外,3D打印结构在培养液中放置一周后,其几何形状和尺寸都保持不变。
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