哈工大3D打印用于血管再生的组织工程支架
根据 EngineeringForLife，3D打印支架技术进行血管再生的主题是一直是研究热点且极具重要性。然而,现有报道中关于这方面研究的系统性总结还相对缺乏。近期来自哈尔滨工业大学的刘海涛副教授团队在Bio-Design and Manufacturing上发表了题为“3D printing of tissue engineering scaffolds: a focus on vascular regeneration”的长篇综述，从5个方面进行了阐述：1）面向血管再生的组织工程支架的意义和重要性；2）血管支架的三维建模方法；3）血管支架中常用的3D打印材料；4）血管支架制造中常见的3D打印技术；5）血管支架的临床转化。此外，鉴于传统制造技术的优势，论文还讨论了血管支架制备中常涉及的其它技术，包括铸造、静电纺丝及乐高积木式构建。
3D打印支架另辟蹊径
细胞的营养物质和氧气供给不足是制备大尺寸组织中面临的挑战。血管为营养物质的运输和组织器官的新陈代谢提供了渠道，且血管相关的疾病已成为主要死亡诱因之一。血管再生目的是修复受损组织和器官的结构和功能。血管再生方法包括：组织工程血管移植物的植入，血管腔中金属或塑料管的放置，手术旁路移植，血管成形术和不可生物降解导管的植入。血管构建旨在采用内皮细胞，平滑肌细胞，干细胞，生物活性分子，生物材料和相应的细胞聚集体或球体制造具有生物学功能和结构的血管。
血管构建的方法包括制造血管支架，血管脱细胞化，自组装血管移植物的制造以及随后的处理工艺（如生物反应器和培养添加剂的引入）。对血管移植物的需求很大，但常规自体植入和同种异体移植无法构造具有给定形状和功能的血管组织。许多传统制造技术可能存在各类缺陷。例如，微成型形成的支架有时缺乏细胞结合位点；自组装技术难以对血管的几何形状进行精确控制，脱细胞方法形成的支架难以细胞浸润。3D打印支架技术为该问题提供了解决方案。
本综述聚焦于现有的建模方法和制造血管支架的常用3D打印技术，系统讨论了3D打印支架技术应用于血管再生的可行性、血管化组织工程策略、支架技术相比无支架技术的优势，介绍了血管支架建模方法，打印材料和制备方法。详细讨论了相关的3D打印技术。另外还给出了3D打印支架技术初步评估支架性质的方法、临床转化过程及未来可能的研究方向（机器学习、近红外光聚合、4D打印、3D打印与自组装技术的结合）。
/1 血管组织工程支架的意义和重要性
- 3D打印支架技术应用于血管再生的可行性：血管为层级结构（图1），3D打印制备这种结构可行；支架为血管细胞提供生长微环境并指导细胞粘附，定位和定植，提供合理空间分布；调控因子可通过支架引入，调节细胞生长。确保可行性方法：通过显微技术评估支架的形状和孔径；液体置换法确定孔隙率；实验评估力学性能，包括弹性模量，断裂强度和柔度等；计算降解后残留质量的百分比评估降解性；结合显微技术和组织学染色评估生物相容性。
- 血管化组织工程策略（图2）：首先，通过参数化建模或基于micro-CT/MRI的3D重建技术建模。随后，采用生物材料墨水或生物墨水，通过3D打印技术制备支架。随后，对支架特性（如，连通性，三维结构，力学和生化特性）进行表征与验证；引入细胞生长所需的生物活性物质以进行血管化。给出了细胞培养过程面临的挑战：细胞培养的最佳培养条件是什么？制备支架后如何调节血管细胞的生长？如何使支架的降解速率与新血管组织的形成速率相匹配？如何使新血管与体内血管融合形成相互连接的血管网络，从而促进新陈代谢和营养物质的输送？
- 支架技术相比无支架技术的优势：通常无支架技术涉及细胞层片或细胞球体。球状体形成方法：微流体技术，球状体形成的基质和悬滴技术。优势：支架技术为细胞繁殖提供更好的空间结构和生长微环境；支架方法打印的血管支架的特性特别是生物力学和生物化学性质可定制；支架易于细胞攀爬和生长。
图1 血管组织结构
图2 血管化组织工程策略
/2 血管支架建模方法
- 参数化设计：三维软件直接建模；基于二次开发技术的三维重建；结合人工智能技术的三维建模
- 逆向工程：micro-CT/MRI扫描。通常流程：三维扫描目标对象、面向DICOM格式的数据格式转换、三维软件重建（如Mimics）
- 逆向工程与参数化设计相结合的方法
表征支架建模适用于体内血管再生的可行性：有限元分析和流体数值模拟预测支架的弹性模量和膨胀与收缩；数值模拟预测氧气和营养物质含量；采用测量软件和其他方法使模型的孔隙率和孔径与原始血管结构相匹配；使设计的模型匹配相应的生理结构。
/3 用于血管支架的3D打印材料
- 打印材料：细胞（间充质干细胞的分化、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞）、生物材料（海藻酸盐、胶原、丝素蛋白、透明质酸、基质胶、明胶、聚己内酯、聚乳酸、聚乙二醇二丙烯酸酯、羟基磷灰石、GelMA、去细胞基质）
- 制作方法：化学方法与物理方法制备（涉及混合，搅拌，溶解，透析，冷冻干燥，挥发，沉淀和超声处理等操作）
- 辅助材料（适用于打印前、打印过程中及后处理工艺）
/4 3D打印血管支架
- 3D打印方法：从打印装置与打印工艺的角度详细综述了挤出3D打印（不限于传统挤出打印，悬浮打印、同轴打印）、喷墨3D打印（传统喷墨打印、电流体动力喷射打印）、光固化3D打印（SLA、DLP、计算轴向光刻）
- 3D打印技术与其它技术的结合：传统铸造/腐蚀铸造与3D打印、静电纺丝与3D打印、乐高积木式构建与3D打印
表征制备的支架应用于单培养与共培养技术中的可行性（以挤出3D打印为例）：利用成像技术与数据模型评估打印误差；确保挤出打印后支架上细胞的准确空间分布；确保支架内部和表面结构与待接种的细胞类型匹配；通过生物学实验评估支架的氧气和养分含量；确保细胞在打印后存活并评估支架的细胞相容性
3D打印的血管维持长期培养的方法：添加成分，包括相应的细胞生长因子，纤连蛋白，肝素，凝血酶等；维持适当的pH值并改善血清质量；利用其他细胞（如成骨细胞和肉瘤来源的细胞）的旁分泌促进血管化
/5 面向临床生产力的转化
- 支架性质（图3）预评估：基于打印技术初步评估支架性质，简化实验验证。支架性质包括：三维结构、连通性、生物物理性质、生化性质
- 临床转化：新冠肺炎诱发系列血管疾病（紧迫性）。初步临床应用前的支架经历两个流程：支架性质实验验证、种植细胞/载细胞支架的培养（通常需引入培养箱或生物反应器）。生物相容性评价方法：MTT测定，荧光染色，流式细胞术等。特异性评价：荧光染色，ELISA或PCR来评估。所涉及的活/死染色和荧光染色可在光/电子或多光子显微镜下可视化。ELISA法可定量测定血管的CD31和VEGF水平及植入血管支架后的炎症因子（如TNF-α，IL-1β和IL-6）），PCR验证特定基因表达。
/6 血管再生的支架研究展望
- 机器学习技术：涉及血管支架建模与生物墨水的设计。墨水的配置目前聚焦于繁琐实验验证，机器学习技术可能简化这一过程
- 近红外光聚合：改善穿透性、光固化范围及彩色模型的打印，避免紫外光固化对细胞影响
- 4D打印：涉及血管支架制造与后处理。可能是高精度支架制备的一个解决方案
- 细胞自组装与3D打印：自组装在微纳尺度范围内调控细胞。一个研究方向是细胞作为支撑材料的悬浮打印
图3 支架性质评估
相关论文：“3D printing of tissue engineering scaffolds: a focus on vascular regeneration”已在Bio-Design and Manufacturing期刊在线刊登。哈尔滨工业大学机电学院王鹏举博士生为第一作者，孙雅洲教授为第二作者，刘海涛副教授为通讯作者。
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国际上，澳大利亚研究机构CSIRO Lab22 增材制造实验室，应临床医生改进镍钛合金自膨胀支架的需求，开发了一种通过选区激光熔化（SLM）3D打印技术制造支架，该支架在设计自由度和可定制方面显示出一定优势。科学家们采用的镍钛合金材料为镍钛诺，这是一种形状记忆合金，在受压时会表现出超弹性。该材料具有独特的晶体结构，晶体结构在受到压力或加热时会发生变化。合金的两个不同相（马氏体和奥氏体）是由温度决定的，而相变温度对支架的制造条件极为敏感。为了使支架表现出自我膨胀，转变温度需要低于体温37°C。此外，SLM 3D打印的工艺参数需要适合制造支架的超细网状结构，包括尺寸为80-200 µm的细支杆。
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