解锁体积生物打印潜能！低强度脉冲超声赋能3D打印支架

zhiyongz 24分钟前阅读数 #技术

尿道狭窄是泌尿外科常见难题，手术治疗常需器官或组织移植，但面临供体不足和排异风险。组织工程研究致力于体外培养组织以解决这一问题，其中生物材料和制造方法是关键。明胶甲基丙烯酰（GelMA）因良好的生物相容性等优势在组织工程中备受关注，而体积生物打印（VBP）能快速制造厘米级构建体且维持高细胞活力。人尿源性干细胞（hUSCs）具有多种优势，是尿道组织工程的理想种子细胞。然而，使用 GelMA - 3D 打印构建宏观尿道组织面临诸多挑战，如维持细胞活力和功能、整合多种细胞类型等。此外，从二维培养到三维环境，确保细胞长期活力和功能是一大难题。低强度脉冲超声（LIPUS）虽被认为可促进细胞增殖，但它对 3D 支架中 hUSCs 的影响尚不明确。
来自广州医科大学第五附属医院的赖德辉教授、卞军教授团队合作利用 VBP 技术将 hUSCs 整合到 GelMA 支架中，研究不同参数的 LIPUS 对 hUSCs 活力的影响，并探索其分子机制。相关工作以 “Low - intensity pulsed ultrasound promotes cell viability of hUSCs in volumetric bioprinting scaffolds via PI3K/Akt and ERK1/2 pathways” 为题发表在《Biomedical Materials》上。

研究内容
1. hUSCs的分离鉴定与多向分化能力验证
通过对健康男性尿液样本进行离心、培养等处理获取hUSCs，运用流式细胞术对其表面抗原进行鉴定，并使用特定诱导培养基进行成骨、成脂分化诱导，再通过茜素红和油红O染色来评估分化情况。结果显示，hUSCs呈现梭形形态，高表达CD44、CD73和CD90等干细胞相关抗原，且能成功分化为成骨细胞和脂肪细胞，具备多向分化潜能。

图1. 负载人尿源性干细胞（hUSCs）的 GelMA 水凝胶支架的 3D 生物打印流程图

图2. 人尿源性干细胞（hUSCs）的分离和表面抗原表型分析

图3. 人尿源性干细胞（hUSCs）的分化潜能

2. GelMA生物支架的制备与特性研究
将GelMA粉末溶解在PBS中，添加交联剂和hUSCs制备生物墨水，利用3D打印技术构建支架，采用扫描电子显微镜（SEM）观察其微观结构，通过压缩测试获取应力 - 应变曲线以分析机械性能，进行体外降解实验探究降解特性。结果表明，GelMA生物支架具有可打印性，呈现多孔结构，孔径在80μm左右，其杨氏模量与浓度呈正相关，在PBS缓冲液中约21天可完全降解，展现出良好的生物相容性和可降解性。

图4. GelMA生物支架的制备和表征

3. LIPUS对2D环境中hUSCs增殖的影响
设置不同的LIPUS强度，对培养在平板上的hUSCs进行刺激，运用CCK - 8检测和活/死染色技术，在不同时间点评估细胞增殖情况。结果表明，在一定范围内，LIPUS能促进hUSCs增殖，其中100 mW/cm^2 强度且连续两次10分钟处理的效果最佳，该条件下hUSCs的细胞密度和增殖活性显著高于对照组。

图5. 不同强度LIPUS对2D培养hUSCs增殖的影响

4. GelMA浓度对hUSCs在3D支架中生长的影响
制备不同浓度（2.5%、5%、7.5%、10%）的GelMA生物支架，将hUSCs接种其中，通过活/死染色在不同时间点观察细胞生长情况。结果显示，2.5% GelMA浓度的支架最有利于hUSCs的黏附和生长，随着GelMA浓度增加，hUSC的黏附数量明显减少，细胞生长状态变差。

图6. GelMA浓度对体积生物打印载细胞GelMA支架中hUSCs增殖的影响

5. LIPUS对3D环境中hUSCs增殖的影响及机制探究
在3D GelMA支架培养体系下，改变LIPUS强度，利用CCK - 8检测、活/死染色、流式细胞术以及Western blot分析等方法，检测hUSCs的增殖、细胞周期分布以及相关蛋白表达水平。结果表明，150 mW/cm^2 的LIPUS对3D支架中hUSCs的增殖刺激效果最佳；LIPUS可促使hUSCs从G0/G1期进入S和G2/M期，增加细胞周期相关蛋白表达，同时激活ERK1/2和PI3K - Akt信号通路，而抑制这两条通路会减弱LIPUS诱导的hUSC增殖作用。

图7. LIPUS对3D GelMA支架中hUSCs增殖的影响

图8. 不同LIPUS强度对3D GelMA支架中hUSCs细胞周期进程的影响

图9. 体积生物打印载细胞GelMA支架中hUSCs的细胞外信号调节激酶（ERK1/2）和PI3K - Akt的磷酸化

研究结论
本研究表明，低强度脉冲超声（LIPUS）可促进 3D GelMA 支架中人尿源性干细胞（hUSCs）的增殖，这可能是通过激活 ERK1/2 和 PI3K-Akt 信号通路实现的。实验数据为在 3D 培养环境中利用 LIPUS 促进 hUSCs 增殖提供了支持。研究确定了适用于 hUSCs 的 LIPUS 最佳参数，即频率 1.5MHz、空间平均时间平均强度（ISATA）为 150 mW/cm^2、每次照射 10 分钟，连续照射两次。同时发现，2.5% 浓度的 GelMA 支架最有利于 hUSCs 的生长和增殖。这些结果为尿道组织工程中应用 LIPUS 和 GelMA 支架提供了理论依据和实践指导。
挑战与展望
在材料方面，GelMA 支架需进一步优化，以更好地平衡物理可打印性与生物相容性，特别是在处理脆弱干细胞时，需在保证细胞活力的同时提升打印性能。在 LIPUS 应用上，虽然确定了促进 hUSCs 增殖的最佳参数，但不同细胞类型对 LIPUS 的反应存在差异，其作用机制尚未完全明确，仍需深入研究。未来，有望开发出更理想的生物材料，与 LIPUS 更有效地结合，构建出更接近人体生理环境的组织模型，推动组织工程和再生医学的发展，为尿道狭窄等疾病的治疗带来新的突破。

文章来源：
https://doi.org/10.1088/1748-605X/ad920f